Op elk moment zijn in ieder lichaam vele miljoenen cellen bezig met een complex proces: het kopiëren van DNA. Voordat een cel namelijk tot delen kan overgaan, wordt elk stukje genetisch materiaal dat erin zit met grote precisie gekopieerd. Hoe deze zogeheten DNA-replicatie in zijn werk gaat, was lange tijd een groot raadsel. Bruce Stillman, hoogleraar biochemie en president van Cold Spring Harbor Laboratory in de Amerikaanse staat New York, leverde belangrijke bijdragen aan het ontrafelen van dit raadsel. In 2020 ontving hij hiervoor de Dr. H.P. Heinekenprijs voor de Biochemie en Biofysica.
The English translation of this article can be found here.
In de werkkamer van Bruce Stillman staat een prachtig kristal, waarop een replica prijkt van de eerste lens die Antoni van Leeuwenhoek maakte. Die lens opende de wereld van microben en cellen voor het menselijke oog. Dit kunstwerk is de Heinekentrofee die hij ontving voor zijn baanbrekende onderzoek. Eén van de eerste dingen die Van Leeuwenhoek rond 1670 door zijn microscoop aanschouwde, was het bezinksel in bier. Aanvankelijk dacht hij dat hij naar wat dode cellen keek, maar later bleek hij gistcellen te hebben gezien, springlevend en essentieel voor het brouwproces van bier. Het toeval wil dat Stillman veel van zijn doorbraken aan een belangrijke keus dankt: zo’n veertig jaar geleden besloot hij om gistcellen te gaan gebruiken voor zijn onderzoek. Het gist S. cerevisiae, dat wordt gebruikt voor het maken van brood, wijn en bier, stelde hem in staat om vele eiwitten te identificeren die een rol spelen bij het kopiëren van DNA in cellen.
‘De mooiste dingen ontdek je door er niet specifiek naar te zoeken’
Medisch bioloog Yvette van Kooyk wil het immuunsysteem leren kankercellen aan te vallen door hun suikerjas-vermomming weg te knippen.
Terwijl Stillman bevlogen over zijn onderzoek vertelt, zijn vele miljoenen cellen in zijn lichaam namelijk druk bezig. Voordat een cel kan delen, worden al het DNA en de bijbehorende eiwitten met grote precisie gekopieerd. Zo wordt er alleen al in het beenmerg een miljard meter DNA per minuut minutieus gekopieerd – een prestatie van jewelste. Maar ondanks de waanzinnig complexe moleculaire machinerie, voorzien van diverse controlemechanismen, gaat dit proces ook weleens mis. ‘Een van de redenen waarom ik in het onderwerp van DNA-replicatie geïnteresseerd raakte, is omdat dit proces fout gaat bij kanker’, vertelt Stillman. ‘Ik wilde begrijpen hoe dit proces eigenlijk werkt, en wat er in dat geval precies misgaat.’ Stillman wijdde zijn carrière aan het ontrafelen van deze biologische kopieermachine. Hij identificeerde samen met zijn collega’s vele eiwitten die een belangrijke rol spelen in het replicatieproces, en ontrafelde hoe deze met elkaar samenwerken.
Als je een DNA-streng wilt gaan kopiëren, zou je kunnen denken: ik begin gewoon aan het ene uiteinde, en kopieer net zolang tot ik aan het andere uiteinde ben gekomen. Maar de harde cijfers drukken je al snel met de neus op de feiten. ‘Als je maar één startpunt zou hebben, een zogeheten origin of replication, dan zou het maanden duren om een volledig chromosoom te kopiëren’, vertelt Stillman. ‘In werkelijkheid zijn er heel veel van deze startpunten. Daardoor neemt het kopieerproces maar zo’n acht uur in beslag in menselijke cellen.’
Simultaankopiëren
Heel efficiënt, maar dit vereist wel een goede coördinatie. De kopieereiwitten moeten allereerst op de een of andere manier weten waar zij moeten beginnen met kopiëren. ‘Je kunt niet twee keer op dezelfde plek beginnen, want dan krijg je dubbele stukjes’, zegt Stillman. ‘Je kunt ook geen beginpunt overslaan, want dan wordt een stuk DNA weggegooid.’ Eén van zijn belangrijkste doorbraken was het ontrafelen hoe deze simultaanstart in goede banen wordt geleid. ‘Het replicatieproces start met het binden van eiwitten aan het DNA op specifieke plekken’, zegt Stillman. ‘De doorbraak die Steve Bell, een postdoc in mijn lab, en ik in 1992 maakten, was de ontdekking van het Origin Recognition Complex. Dat is de enzym-machinerie die het hele proces in gang brengt.’
Klaar voor de start? Af!
Dit Origin Recognition Complex, kortweg ORC, is een eiwit dat een startpunt in de DNA-streng herkent en zich hieraan bindt. Vervolgens verzamelt ORC een serie andere eiwitten om zich heen, waarvan Stillman ook een groot deel identificeerde. Allen tezamen vormen ze het zogeheten pre-replicative complex. Dit complex geeft als het ware ‘toestemming’ om de DNA-replicatie te starten. Als het startsein is gegeven, beginnen de kopieereiwitten vanaf de startpunten te kopiëren. Vervolgens wordt het pre-replicative complex vernietigd. ‘Dit complex kan dan niet meer opnieuw samen worden gebracht totdat de volledig gekopieerde en originele chromosomen uit elkaar worden getrokken en in twee aparte celkernen worden ondergebracht’, vertelt Stillman. ‘Dit zorgt ervoor dat het kopieerproces niet meerdere keren kan worden opgestart binnen één celcyclus.’
Om erachter te komen hoe dit allemaal precies werkt, moesten Stillman en collega’s een manier vinden om onderscheid te maken te maken tussen het vormen van het pre-replicative complex en het daadwerkelijke kopiëren van het DNA. Eerst bestudeerden ze hiervoor virussen die cellen van primaten infecteren. In die cellen gebruikt het virus vrijwel dezelfde machinerie als de primaten om zijn virale DNA te repliceren. Dezelfde eiwitten die het menselijke DNA kopiëren, kopiëren dus ook het virale DNA. ‘In mijn laboratorium en dat van mijn collega Thomas Kelly hebben we veel van deze eiwitten geïdentificeerd’, vertelt Stillman. ‘Dankzij dit onderzoek ontdekten we vele eiwitten die een belangrijke rol spelen in het menselijke replicatieproces.’
Bakkersgist
Maar voor het vraagstuk hoe dit replicatieproces op gang komt in chromosomen in cellen, boden de virussen geen soelaas. Een belangrijke stap in de richting van het ontrafelen van dit raadsel, was de keuze om met gist te gaan werken. Stillmans oog viel op Saccharomyces cerevisiae, een gist die wordt gebruikt om brood, wijn en bier te maken. Gist bleek een perfect organisme voor zijn onderzoek, omdat het hem in staat stelde zowel biochemische als genetische technieken toe te passen. ‘De reden dat we met gist gingen werken, was dat er aanwijzingen waren dat de startpunten, de origins of replication, in gist gedefinieerd worden door specifieke DNA-sequenties.’
Dit bleek inderdaad zo te zijn. Stillman en student York Marahrens onderzochten stapsgewijs welke nucleotiden (de bouwstenen van DNA, beter bekend onder de letters A, C, G en T) vereist zijn voor de replicatie van DNA. Dit deden ze door normale DNA-strengen met gemuteerde versies te vergelijken. ‘Op deze manier identificeerden we vier stukjes DNA-code die vereist zijn voor de replicatie van DNA’, zegt Stillman. ‘We hadden origins die werkten, en origins die niet werkten. Het verschil tussen de werkende en niet werkende versies was slechts één letter in de genetische code. Collega Stephen Bell gebruikte die informatie om eiwitten te identificeren die wel aan de werkende origins bonden, en niet aan de niet-werkende.’ De eiwitten die aan de werkende origins bonden, vormden samen wat ze het Origin Recognition Complex noemden.
Goede keuze
In hun onderzoek met gist ontdekten ze niet alleen ORC, maar ook andere eiwitten die samen met ORC het pre-replicative complex vormden, niet alleen in gistcellen. ‘Uiteindelijk vonden we in mijn lab ook het menselijke ORC, door het evolutionaire pad van gist naar mensen te volgen’, vertelt Stillman. ‘Ik wist destijds echt dat dit een heel nieuw onderzoeksveld zou openen. Maar toen we ORC vonden, waren we aanvankelijk erg behoedzaam. Mensen hadden namelijk al eerder geclaimd het kritieke eiwit te hebben gevonden, dat aan de origins bond. Dat bleek telkens niet te kloppen. Mensen begonnen te geloven dat een dergelijk eiwit helemaal niet bestond. Maar dankzij onze analyse met de origin-mutanten was het bewijs heel sterk. Het is erg belonend om zes of zeven jaar aan een hypothese te werken die heel goed fout zou kunnen zijn, maar die uiteindelijk juist blijkt.’
Recentelijk realiseerde Stillman zich pas ten volste hoe gunstig hun keuze voor bakkersgist was geweest. In 2020 publiceerde hij een paper over de evolutie van ORC. Hierin toonde hij aan dat bakkersgist en wat gerelateerde gisten de enige soorten zijn op de planeet waarbij de origins worden gekenmerkt door specifieke DNA-sequenties. Alle andere organismen − schimmels, insecten, planten, dieren − hebben dat niet. In elk ander organisme was het dus heel moeilijk geweest om ORC te vinden met hun mutatie-analyse. En het had zomaar gekund dat ze een ander organisme hadden gekozen. ‘In het midden van de jaren tachtig sprak ik met gistonderzoekers’, zegt Stillman. ‘Ik vroeg ze hoe het was om biochemie te doen met gist. Een aantal van hen zei: doe het niet, het is verschrikkelijk. Gelukkig hebben we destijds niet naar ze geluisterd.’
Verpakken
Naast de start van het replicatieproces ontrafelde Stillman vele andere aspecten. ‘Een van die ontdekkingen herinner ik me nog heel goed. Ik werkte toen zelf nog in het lab en identificeerde voor het eerst het eiwit dat we CAF-1, Chromatin Assembly Factor 1, noemden.’ CAF-1 helpt verpakkingseiwitten te binden rondom het net gekopieerde DNA. Uiteindelijk vormt het DNA samen met deze verpakkingseiwitten een structuur die ervoor zorgt dat het goed beschermd opgeborgen zit. ‘Dat moment zal ik altijd onthouden. Ik ging zitten en dacht: dit wordt echt groot.’ Stillman ontdekte samen met collega’s nog vele andere eiwitten, waaronder het zogeheten Replicatie-eiwit A, een eiwit dat zich aan een enkele streng DNA bindt om te zorgen dat deze niet opkrult tijdens het kopiëren, ABF-1, een van de eiwitten die binden op plekken waar het kopiëren start, en Replicatiefactor C, een eiwit dat CAF-1 helpt met het verpakken van het gekopieerde DNA.
‘En het blijkt dat al deze eiwitten niet alleen een rol spelen in DNA-replicatie’, zegt Stillman. ‘Ze spelen ook een belangrijke rol in DNA-reparatie, DNA-recombinatie (dat onder andere plaatsvindt bij het mixen van het DNA van twee ouders), en een proces dat checkpoint signaling heet. Als er tijdens de DNA-replicatie schade wordt ontdekt, bijvoorbeeld veroorzaakt door UV-licht of röntgenstraling, dan wordt er een signaal gestuurd dat de cyclus van celdeling moet stoppen totdat er reparatie heeft plaatsgevonden. Replicatie-eiwit A blijkt het primaire signaal hiervoor te zijn.’
In het geval van schade verteren reparatie-enzymen de beschadigde DNA-streng, waardoor enkelstrengs DNA achterblijft. Dit hoort niet thuis in een menselijke cel, waar al het DNA zich netjes in de dubbele-helix-structuur bevindt. ‘Replicatie-eiwit A bindt zich aan dat enkelstrengs DNA, en dat is het signaal voor het tijdelijke stopproces. De celdelingscyclus kan pas weer doorgaan als de schade is hersteld, door opnieuw dubbelstrengs DNA te creëren’, zegt Stillman. ‘Ik ben er best trots op dat deze eiwitten in heel veel verschillende processen een rol spelen. De impact is veel breder dan we dachten toen we hiermee begonnen.’
Waar gehakt wordt, vallen spaanders
Niet alleen omgevingsfactoren zoals uv-licht of röntgenstraling kunnen schade veroorzaken. Als je bedenkt hoe ingewikkeld het DNA-replicatieproces is, en hoeveel verschillende eiwitten erbij betrokken zijn, is het niet moeilijk voor te stellen dat er heel af en toe iets misgaat bij het kopiëren zelf. ‘Alleen al in het beenmerg worden 500 miljoen rode en witte bloedcellen per minuut geproduceerd’, vertelt Stillman. ‘Vermenigvuldig dat met de 2 meter aan DNA die in elke cel gekopieerd moet worden, dan betekent dat dat er elke minuut een miljard meter DNA wordt gekopieerd. Daarmee kun je de aarde langs de evenaar zo’n 25 keer omwikkelen. We weten tegenwoordig dat ongeveer de helft van alle kankers niet wordt veroorzaakt door omgevingsinvloeden zoals zonlicht of roken, maar door het intrinsieke proces van het maken van fouten tijdens het dupliceren van DNA. Die mutaties stapelen op gedurende iemands leven. En ook al is het proces van DNA-replicatie heel accuraat, als we het nóg accurater kunnen maken, dan zouden we het krijgen van kanker in mensen hun leven significant verlangzamen. Het zou prachtig zijn als we dat voor elkaar kunnen krijgen.’
Zeldzame genetische aandoening
Naast kanker levert het onderzoek van Stillman ook een belangrijke bijdrage aan het begrijpen van een heel andere ziekte. In 2011 stuitte hij op een serie publicaties over een zeer zeldzame genetische aandoening: het Meier-Gorlinsyndroom. Mensen met deze aandoening lijden aan een bijzondere vorm van dwerggroei. In tegenstelling tot meer voorkomende vormen van dwerggroei, is bij mensen met Meier-Gorlin ook het hoofd kleiner dan normaal, evenredig met hun kleinere lichaam. Maar ondanks dat deze patiënten grofweg een twee keer zo klein brein hebben, is hun intelligentie niet noodzakelijkerwijs lager dan gemiddeld. Volgens de publicaties vormden mutaties in DNA-replicatiegenen, die voor ORC en andere eiwitten coderen, de oorzaak van het syndroom. Maar puur door fouten in het DNA-replicatieproces konden de symptomen niet verklaard worden. ‘Door ons onderzoek weten we inmiddels dat ORC en andere replicatie-eiwitten een veel grotere rol spelen in de celcyclus’, zegt Stillman. ‘Juist veel van deze andere functies bleken aangetast te zijn bij mensen met het Meier-Gorlinsyndroom. Zo konden we dankzij ons fundamentele onderzoek dit syndroom verklaren.’
Maar het meest waardevol vindt Stillman die fundamentele kennis zelf. ‘Ik heb veel geluk gehad dat ik de ontdekkingen kon najagen die in studieboeken eindigen, en deel vormen van de kennis over wie we zijn, en hoe onze genetische informatie wordt doorgegeven van een generatie naar de volgende. Ik vind het heel bijzonder dat het menselijke genoom gensequenties deelt met bacteriën die vele miljarden jaren geleden zijn geëvolueerd en met de gisten die honderden miljoenen jaren tot een miljard jaar geleden zijn geëvolueerd. Hun DNA-sequenties zijn dus al die tijd gekopieerd om uiteindelijk moderne soorten te produceren met verwante genen. De evolutie heeft processen in stand gehouden die heel lang geleden zijn ontstaan. De eiwitten die DNA kopiëren, die vergelijkbaar zijn in gist en mensen, doen dat dus al een heel lange tijd.’
CV
Bruce Stillman (Melbourne, Australië, 1953) studeerde aan de Universiteit van Sydney, en promoveerde aan de John Curtin School of Medical Research aan de Australian National University. Vervolgens zette hij zijn carrière voort in de Verenigde Staten, waar hij startte als postdoc aan Cold Spring Harbor Laboratory in de staat New York. Sinds 1985 is hij hier hoogleraar biochemie. In 1994 werd hij directeur van Cold Spring Harbor Laboratory, en sinds 2003 bekleedt hij hier de functie van president. Naast de H.P. Heinekenprijs voor de Biochemie en Biofysica ontving Stillman onder andere de Herbert Tabor Research Award, de Louisa Gross Horwitz Prize, de Canada Gairdner International Award en de Australian Advance Global Impact Award.
Onderzoek
Bruce Stillman onderzoekt hoe het replicatieproces van DNA werkt in eukaryotische cellen: cellen die een celkern bevatten. Hieronder vallen de cellen van bijna alle meercellige organismen, zoals planten, dieren en mensen, maar ook vele eencellige organismen, zoals gist. Dankzij zijn onderzoek begrijpen we beter hoe ons erfelijk materiaal wordt gekopieerd en hoe dit samenhangt met andere processen in de cel. Stillman onderzoekt ook hoe dit proces fout gaat bij ziekten zoals kanker. Ook gaf zijn onderzoek een verklaring voor een zeldzame genetische aandoening: het Meier-Gorlinsyndroom.
Heinekenprijzen
Elke twee jaar kent de Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen de Heinekenprijzen toe aan vijf gerenommeerde internationale onderzoekers en één kunstenaar. De eerste van de prijzen, de Dr. H.P. Heinekenprijs voor de Biochemie en Biofysica, werd in 1964 in het leven geroepen door Alfred H. Heineken, als eerbetoon aan zijn vader, dr. Henry P. Heineken. Aan deze prijs werden vervolgens nog Heinekenprijzen voor de Kunst (1988), de Geneeskunde (1989), de Milieuwetenschappen (1990) en de Historische Wetenschap (1990) toegevoegd. De dochter van Alfred Heineken, Charlene L. de Carvalho-Heineken, zet deze traditie voort. Naar haar is de C.L. de Carvalho-Heinekenprijs voor de Cognitieve Wetenschappen (2006) vernoemd.